Juan Diego Botto nació el 29 de agosto de 1975 en Buenos Aires, Argentina. Es hijo de la actriz argentina y profesora de interpretación Cristina Rota, y del actor argentino Diego Botto, quien desapareció en 1977 durante la campaña de terror de la dictadura argentina de Videla. La pareja tenía una hija mayor, la también actriz María Botto (1974).^[1]​^[2]​

En 1978, cuando tenía solo 2 años, su madre embarazada de una nueva pareja decidió abandonar el país y trasladarse a España, donde dio a luz a su hija, la también actriz Nur Levi (1979). La familia fijó su residencia permanentemente en España gracias a la doble nacionalidad, y donde desde entonces Botto se crio y residió.^[3]​

Botto estudió interpretación en la escuela fundada por su madre en Madrid, germen del posterior Centro de Nuevos Creadores, con sede en la Sala Mirador, por donde han pasado algunos de los mejores actores y actrices españoles. Más tarde se trasladó a Nueva York para continuar sus estudios bajo la dirección de Uta Hagen.^[4]​

Su primera aparición en el cine fue a la edad de 8 años en la película Juego de poder, de Fausto Canel (1983).^[5]​

Durante la década de los 80 hace pequeños papeles en películas, e incluso consigue un rol importante en la famosa serie de televisión estadounidense de 1990 El Zorro, hasta que en 1992 logra un papel como hijo de Cristóbal Colón en la película 1492: La conquista del paraíso, de Ridley Scott. Tres años después protagoniza la película Historias del Kronen, de Montxo Armendáriz, con la que alcanzó gran éxito y popularidad.^[6]​

Desde entonces, su carrera ha contado con conocidas películas, como Martín (Hache), del director Adolfo Aristarain, Silencio roto, de Montxo Armendáriz, Plenilunio, de Imanol Uribe, Asfalto, de Daniel Calparsoro, Vete de mí, de Víctor García León, Todo lo que tú quieras, de Achero Mañas, entre otras, así como varios trabajos en el extranjero, como The Dancer Upstairs (Pasos de baile), dirigida por John Malkovich y protagonizada por Javier Bardem, Bordertown (Ciudad del silencio), de Gregory Nava, protagonizada por Jennifer López, La mujer del anarquista, de Marie Noëlle y Peter Sehr, y El Greco, de Yannis Smaragdis, por la que obtuvo en 2008 el Premio al Mejor Actor en el Festival de Cine de El Cairo.^[5]​^[7]​^[8]​

En su carrera profesional ha compaginado siempre el cine y el teatro. Es coordinador del teatro Sala Mirador.^[9]​

En 2005 dirigió la obra de teatro El privilegio de ser perro, escrita por él mismo. En diciembre de 2008, y tras una gira por toda España, estrenó en el Teatro María Guerrero de Madrid Hamlet, dirigida y protagonizada por él, junto con José Coronado, Marta Etura y Nieve de Medina, entre otros. También es autor de las obras de teatro Despertares y celebraciones, dirigida por su madre Cristina Rota, y La última noche de la peste, dirigida por Víctor García León.^[10]​^[11]​^[12]​^[13]​

En 2012 escribe la obra de teatro Un trozo invisible de este mundo. El texto, que trata sobre la inmigración y el exilio, mezcla drama y humor con compromiso. En ella actúa dirigido por Sergio Peris-Mencheta. Juan Diego Botto obtuvo en 2014 los Premios Max de Teatro a Mejor Actor y Mejor Autor Revelación por dicha obra, que se hizo además con el Premio Max a Mejor Obra del año.^[14]​^[15]​

En el cine ha recibido numerosas distinciones. Ha sido cuatro veces nominado a los Premios Goya por sus participaciones en las películas Historias del Kronen, Plenilunio (2000), Vete de mí (2006) e Ismael (2013), respectivamente. También su carrera en el teatro le ha hecho ganador de un Premio Fotograma de Plata a mejor actor de teatro en 2008 por su participación en Hamlet, así como dos premios Max y un Premio Cosmopolitan.^[16]​^[14]​

En la década de 2010 participó en las películas Silencio en la nieve (2012), de Gerardo Herrero, Ismael (2013), de Marcelo Piñeyro, Hablar (2015), de Joaquín Oristrell, y La ignorancia de la sangre (2014), de Manuel Gómez Pereira.^[17]​^[18]​^[19]​^[20]​

En 2016 participó en la serie Good Behavior, del canal TNT. En ella interpreta a Javier, un asesino a sueldo que se cruza con Letty (Michelle Dockery), una ladrona profesional. Bajo su frío y calculador trabajo, ambos esconden una realidad familiar dura y oscura.^[21]​^[22]​

En enero de 2017 trabajó en la serie de suspenso Pulsaciones, de Antena 3, donde interpreta a Rodrigo Ugarte.^[23]​

En el verano de 2021, formó parte del elenco de la superproducción El Escuadrón Suicida dirigida por James Gunn.^[24]​

En septiembre de 2021, le fue otorgado el Premio Nacional de Teatro.^[25]​

En octubre de 2022 estrena su primer largometraje como director, titulado En los márgenes con Penélope Cruz y Luis Tosar como protagonistas.^[26]​

En marzo de 2025 coprotagonizó Los aitas una película de Borja Cobeaga.^[27]​

• El privilegio de ser perro, debut como dramaturgo y director de escena.
• Despertares y celebraciones, coescrita con su madre y dirigida por ella.
• La última noche de la peste, dirigida por Víctor García León.
• Un trozo invisible de este mundo, dirigida por Sergio Peris-Mencheta.
• Una noche sin luna, dirigida por Sergio Peris-Mencheta.

• El privilegio de ser perro
• Hamlet

• Assassin's Creed 2, pone la voz al personaje de Leonardo Da Vinci en el juego.^[36]​

Premios Goya

Premios Ondas

Premios Feroz

Premios de la Unión de Actores

Premios Fotogramas de Plata

Premios del Festival de Cine de El Cairo

Premios Max de Teatro

Premios Cosmopolitan

Otros

•   Wikimedia Commons alberga una categoría multimedia sobre Juan Diego Botto.
• Juan Diego Botto en Internet Movie Database (en inglés).
• Entrevista en marzo de 2004 en el periódico El Mundo