Fue hijo de John Brookes Johnstone y de Esther Laetitia Hamilton. Estudió gramática en el King´s College de la Universidad de Londres y pintura durante cuatro años en la Royal Academy. Terminados sus estudios, viajó por Europa y norte de África, donde visitó el interior de Túnez. ^[1]​

En 1882, visitó la zona meridional de Angola y al año siguiente, junto a Henry Morton Stanley, se internó en el Congo. Su reputación le permitió dirigir la Royal Geographical Society. En 1884, la British Association for the Advancement of Science le encargó dirigir la expedición británica científica al Kilimanjaro.^[1]​

En octubre de 1886, el gobierno británico le designó vicecónsul en Camerún y en el área del delta del río Níger, donde se mantenía un protectorado desde 1885, siendo nombrado cónsul en 1887. En 1889, acordó con Portugal una distribución de las áreas de influencia de ambos países en el sureste de África. Realizó numerosas acciones diplomáticas tendentes a expandir el imperio británico por toda la zona, consiguiendo finalmente en 1891 la constitución del Protectorado Británico del África Central o Nyasalandia. ^[1]​

En abril de 1894, Johnston regresó a Inglaterra. Tuvo un conflicto con Cecil Rhodes, quien hasta entonces había proporcionado la mayor parte de sus fondos, y había acumulado un déficit de 20.000 libras esterlinas. Durante su permiso, Johnston logró persuadir al gobierno británico para que se hiciera cargo de la financiación y dirección del Protectorado Británico del África Central. A su regreso, visitó Egipto y la India con el objetivo de reclutar soldados, y finalmente regresó a Nyasalandia. En junio de 1895, Johnston viajó a Karonga, en la región norte de Malaui, para intentar llegar a un acuerdo con los líderes suajili, pero estos se negaron a reunirse y a reducir sus incursiones, por lo que Johnston optó por la acción militar. En noviembre de 1895, rodeó la principal ciudad fortificada suajili, bombardeándola durante dos días y finalmente asaltándola. El líder suajili, Mlozi, fue capturado, sometido a un breve juicio y ahorcado el 5 de diciembre, y entre 200 y 300 combatientes suajili y varios cientos de no combatientes murieron, muchos de ellos al intentar rendirse. Otras fortificaciones suajili no resistieron y fueron destruidas. ^[2]​^[3]​

Johnston se preocupó por la importancia estratégica del lago Tanganica para los intereses británicos, ya que el territorio entre este lago y la costa se había convertido en el África Oriental Alemana, lo que impedía la continuidad territorial entre las colonias británicas del norte y el sur de África. Pero dado que el extremo norte del lago estaba a solo 230 kilómetros de Uganda, controlada por los británicos, impulsó la presencia británica en el lago como una prioridad: se establecieran asentamientos británicos al este del río Luapula, en el lago Mweru Wantipa y en Fort Jameson, entre Mozambique y el valle de Luangwa, para demostrar una ocupación británica efectiva. ^[4]​

Hasta 1899, Johnston ejerció el control administrativo del territorio que se convertiría en Rodesia del Nordeste (la mitad noreste de la actual Zambia), y ayudó a establecer y supervisar la administración de la Compañía Británica de Sudáfrica en esa zona. ^[5]​

En 1896, enfermó por fiebres tropicales y se trasladó a Túnez como cónsul general. En 1899, fue enviado a Uganda como comisionado especial para reorganizar la administración de ese protectorado. Mejoró la administración colonial y concluyó el Acuerdo de Buganda de 1900, dividiendo la tierra entre el Reino Unido y los jefes locales. ^[1]​

En 1903 y 1906, se presentó como candidato al parlamento por el Partido Liberal, pero no tuvo éxito en ninguna de las dos ocasiones. En 1906, los Johnston se mudaron a la aldea de Poling, cerca de Arundel, donde Johnston se dedicó principalmente a escribir novelas y completar los relatos de sus viajes por África central. Intervino en el acto celebrado en marzo de 1913 en el Royal Albert Hall para celebrar el centenario del nacimiento de David Livingstone, expresando sus sentimientos sobre lo que llamó la "consideración inadecuada" mostrada a Livingstone durante su vida.

Johnston sufrió dos derrames cerebrales en 1925, por los cuales quedó parcialmente paralizado, y falleció dos años después.

Harry Johnston fue un excelente pintor e ilustrador. La mayoría de sus obras, muy valoradas en la actualidad, representan aspectos diversos de la naturaleza, los paisajes y las gentes de África.

Un hecho destacable en su actividad como naturalista es el de haber realizado las primeras descripciones del okapi, en el año 1900, a partir de restos facilitados por los habitantes nativos. Con ellos pudo hacer las primeras ilustraciones de este animal, incluso antes de haberse capturado uno vivo. El animal fue nombrado Okapia johnstoni en su honor. ^[1]​

También se nombraron en su honor dos especies de lagartos africanos, Trioceros johnstoni y Latastia johnstonii.

• The River Congo from its mouth to Bolobo (1884)

• The Kilema-Njaro Expedition. Londres (1886)

• The History of a Slave (1889)

• Livingstone and the exploration of Central Africa. Londres (1891)

• British Central Africa (1897)

• The Colonization of Africa (1899)

• A history of the colonization of Africa by alien races. Cambridge (1899)

• The Uganda Protectorate, 2 v. (1902)

• The Nile Quest: The Story of Exploration (1903)

• Liberia (1906)

• George Grenfell and the Congo (1908)

• The Negro in the New World (1910)

• The Opening Up of Africa (1911)

• Phonetic Spelling (1913)

• A Comparative Study of the Bantu and Semi-Bantu Languages (1919, 1922)

• The Gay-Dombeys (1919) – secuela de Dombey e hijo de Charles Dickens

• Mrs. Warren's Daughter— secuela de Mrs. Warren's Profession de George Bernard Shaw

• The Backward Peoples and Our Relations with Them (1920)

• The Story of my Life (1923) – autobiografía

• The Veneerings – secuela de Nuestro común amigo de Charles Dickens

• 1902: medalla de oro de la Sociedad Zoológica de Londres

• 1902: doctor honoris causa Universidad de Cambridge

• 1901: Una nueva especie, el okapi, recibe el nombre de Okapia johnstoni en su honor y como reconocimiento a los trabajos que realizó para su descubrimiento.

La caída de agua, en Mambidima, del río Luapula fueron nombrados Johnston Falls por los británicos, en su honor.

• La abreviatura «H.H.Johnst.» se emplea para indicar a Harry Johnston como autoridad en la descripción y clasificación científica de los vegetales.^[6]​

• «Harry Hamilton Johnston». Índice Internacional de Nombres de las Plantas (IPNI). Real Jardín Botánico de Kew, Herbario de la Universidad de Harvard y Herbario nacional Australiano (eds.). 

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• Fotografías de Henry Johnston Archivado el 30 de septiembre de 2007 en Wayback Machine. en la Royal Geographic Society.