Nació en Marcos Juárez, ciudad cordobesa de alrededor de 30,000 habitantes. A los dieciocho años se mudó a Buenos Aires para estudiar Comunicación Social. Luego cambió por Filosofía y Letras en la Universidad de Buenos Aires (UBA); paralelamente estudiaba teatro, y a medida que comenzó a conseguir papeles como actor, a partir del 2002, fue relegando la facultad hasta llegar a hacer una materia por año, casi como hobby.^[1]​

Disco genética en movimiento, La espuma, El deseo atrapado por la cola y Emociones son algunas de las obras en las que participó. Mientras que en cine se lo vio en Sangre, Rodrigo, la película, Corazón iluminado, Perro amarillo, Nacido y criado, El resultado del amor, Como un avión estrellado y Futuro perfecto, entre otros filmes.

En el año 2004 debutó como director del corto Caíto, con el que ganó el Premio Méliès de ese año, entregado conjuntamente por la Embajada de Francia y la Cinemateca Argentina. Cada año el premio gira en torno a un tema, que en esa ocasión fue el deseo. El corto es como un documental autorreferencial sobre la parte de su familia que quedó en Marcos Juárez, y su relación con su hermano, con quien se lleva catorce meses que tiene una discapacidad motriz que se llama distrofia muscular.^[2]​

En 2010 fue uno de los principales actores de la película Belgrano.

En 2011 filmó Caíto, su ópera prima como director, que rodó en la provincia argentina de Córdoba.^[3]​ En 2016, protagonizó la película Tiempo muerto en la cual interpretó a Franco.^[4]​ Poco después, Pfening estelarizó la cinta Amor de película en el papel de Alejandro Monferrán.^[5]​^[6]​

Tiene una hija llamada Asia, nacida en 2014, que tuvo con la asistente de cámara Cintia Pinasco, no estando vinculados emocionalmente como pareja, siendo fruto de un acuerdo de amistad.^[7]​ Actualmente, el actor cuida a su hija junto con su pareja, Rafael.^[8]​^[9]​

• Guillermo Pfening en Internet Movie Database (en inglés).