Era hermano de Enrique de Guisa, segundo hijo de Francisco II de Guisa y de Ana de Este. Sus abuelos maternos eran Hércules II de Este, duque de Ferrara, Módena y Reggio, y Renata de Francia. Fue duque de Mayena de 1573 a 1611, y se le conoce históricamente como el duque de Mayena, o simplemente Mayena, que es como le llamaba Enrique IV de Francia.

Partidario de la Liga Católica, desempeñó el cargo de primer chambelán y se le otorgó (1585) el gobierno de Borgoña. Tras el asesinato de su hermano fue elegido jefe de guerra por el consejo parisiense de los dieciséis. Acompañó al futuro Enrique III a Polonia.

Durante la Sexta Guerra de Religión (1576-1577) arrebató Brouage y La Mure a los protestantes. Fue almirante de Francia hasta 1582, en que cedió el puesto al duque de Joyeuse. Tras el asesinato de su hermano Enrique pasó a ser el jefe de la Santa Liga. Después del asesinato de Enrique III en 1589, trató infructuosamente de proclamar rey al cardenal de Borbón. Fue derrotado en Arques (1589) e Ivry (1590) por Enrique IV.

En 1591, mandó ahorcar a los dirigentes de la Liga parisina, los cuales a su vez acababan de mandar ahorcar a Barnabé Brisson, primer presidente del Parlamento de París, marcando de ese modo la ruptura entre la Liga nobiliaria y la Liga urbana. Fracasó en su intento de que los Estados Generales que había convocado en París en 1593 le nombraran rey. El 5 de junio de 1595, Enrique IV lo volvió a derrotar en la Batalla de Fontaine-Française y Carlos hizo acto solemne de sumisión al rey en noviembre de 1595, a cambio de 2.640.000 libras y tres plazas de seguridad durante seis años (Seurre, Soissons y Chalon-sur-Saône) en Borgoña, de la que perdió el gobierno.

Se había casado, el 6 de agosto de 1576, con Enriqueta de Saboya-Villars (muerta en 1611), y tuvieron cuatro hijos:

• Enrique (1578-1621), duque de Mayena y de Aguillon.
• Carlos Manuel (1581-1609), conde de Sommerive.
• Catalina (1585-1618), casada en 1599 con Carlos I Gonzaga (1580-1637), duque de Mantua.
• Renata (muerta en 1638), casada en 1613 con Mario II Sforza (1594-1658), duque de Ognano y de Segni, conde de Santa Fiora.

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