Es el personaje principal del juego. Tras caer al mundo de los monstruos, comienza un viaje para regresar a la superficie enfrentándose y haciendo amistad con los diversos habitantes. A medida que avanza, ayuda a develar secretos y maquinaciones que han estado en marcha desde la llegada del primer humano al subsuelo hace siglos.

Su nombre original, Frisk, solamente es conocido al final de la ruta pacifista, por lo que antes, los monstruos se refieren a este como «El Humano». Su “determinación” le proporciona la habilidad de recuperarse de cualquier golpe y si muere, es capaz de regresar en el tiempo a través de los puntos de guardado. También tiene el poder de reiniciar todo, aunque eso no incluye la memoria de algunos de los monstruos jefes como Sans y Flowey. En la ruta genocida, se encuentra con Chara, el primer humano en caer al subsuelo.

Los jugadores pueden renombrar al personaje, incluyendo nombres que consisten en secuencia confusa o aleatoria de caracteres, pero no pueden usar nombres de la lista de nombres inapropiados del juego. Además, si se regresa a su nombre original, cambiará la dificultad.

Es una cabra antropomórfica, reina de los monstruos y guardiana de las ruinas (nuestra madre en el juego:) . Su nombre deriva de la palabra tutorial al suprimirse la primera sílaba y cambiando la "a" de tutorial por una "e". Realiza un recorrido con el protagonista por las ruinas para darle a conocer las bases del juego y los sistemas de defensa y ataque: también le enseña a esquivar y hablar con el oponente.

Se muestra extremadamente maternal hacia el humano, hasta el punto de querer adoptarlo para protegerlo del rey Asgore. Ante la negativa de Frisk, Toriel se convierte en el primer jefe oponente, pues tiene la intención de probar la capacidad del humano para sobrevivir.

Siente gran aprecio por Sans y es la única persona que considera graciosas sus bromas, ya que comparten el mismo sentido del humor; a pesar de ello, no se ven frente a frente hasta el desenlace de la ruta pacifista. Se separó de Asgore después que este decretara que cualquier humano que cayera al subsuelo sería asesinado y su alma usada para romper la barrera, razón por la que ahora es muy fría con él.

Es incapaz de matar al jugador por más que este le hiera y en el final pacifista propone a Frisk, por segunda vez, adoptarle además de cumplir su sueño de ser profesora.

Es el rey de los monstruos. Tiene aspecto similar al de una cabra gigante con una melena de león. Quiere obtener siete almas humanas para poder destruir la barrera entre el subsuelo y la superficie e iniciar así una nueva guerra contra los humanos.

A pesar de ser un rey amado por casi todos los monstruos, su situación lo obliga a cometer acciones que le atormentan, pero que considera correctas para devolver la esperanza a sus aliados. Le gusta cuidar de sus flores y sentarse a conversar mientras toma té. Su arma es un tridente rojo.

Es una flor amarilla parlante. A diferencia del resto de flores parlantes del videojuego, no imita sonidos o conversaciones que ha oído, sino que puede comunicarse, al contar con consciencia propia. Es el primer personaje que Frisk encuentra en el juego. Le enseña al jugador el sistema de combate de Undertale y sigue al protagonista en el transcurso de su viaje.

Finalmente, se descubre que lo que enseñó al principio del juego era falso, ya que desea obtener el poder de las almas; si al final del juego logra robar las almas humanas y obtener su poder, se convertirá en un monstruo gigantesco y de gran dificultad que representa uno de los jefes finales más difíciles. Es el jefe final de la "ruta neutral" y "pacifista".

Fue creado por la Dra. Alphys tras inyectarle determinación a una flor pero, al no tratarse de un ser con alma, es incapaz de tener sentimientos llevándolo a pensar que en esta vida todo es “matar o morir”.

Dentro de sí, yacen las memorias y pensamientos de Asriel Dreemurr, hijo de Toriel y Asgore y hermano de Chara como se ve en la "ruta pacifista".

El príncipe del subsuelo, hijo del rey Asgore y de la reina Toriel. Tras la muerte de Chara, absorbe su alma y cruza la barrera para regresar su cuerpo a la superficie, cumpliendo su último deseo de regresar a su pueblo y ver las flores doradas. Sin embargo, los humanos malinterpretan la situación pensando que asesinó a Chara, motivo por el cual lo atacan en horda sin piedad. Herido de muerte, vuelve al subsuelo, antes de desvanecerse en la sala del trono. Posteriormente, fue resucitado por la doctora Alphys, en forma de flor dorada y carente de alma, llamada Flowey.

Es una científica al servicio del rey Asgore. Tiene la apariencia de un dinosaurio amarillo con gafas y una bata de laboratorio. Se muestra tímida, insegura y con baja autoestima. Le gusta el anime, principalmente el yuri, y es prácticamente una experta en el campo de la mecánica y electrónica.

Es la creadora del cuerpo de Mettaton. Ayuda al protagonista en distintas fases del juego.

Vive atormentada por los errores que cometió experimentando en busca de una solución contra la barrera y siendo la causante del nacimiento de Flowey.

Es un robot construido por la Dra. Alphys, de carácter carismático y sarcástico que dirige el programa de televisión del subsuelo "MTT". Intentará matar al humano en repetidas ocasiones para atravesar la barrera y hacerse famoso en la superficie.

Este robot está descontrolado por su sed de aumentar el índice de audiencia de su programa. Impone un duelo al jugador donde, además de incluir ataques físicos, debe actuar teatralmente, ya que su objetivo es dar un “buen espectáculo” al público. Por esto, a pesar de lograr esquivar y atacar, si el jugador no logra elevar el índice de audiencia del show de Mettaton sobre cierta cifra, pierde la batalla. En el encuentro final con él, Alphys le dice al jugador que él será vulnerable si activa su interruptor detrás de él, lo que lo convertirá en Mettaton EX, una versión con cuerpo "Humano" que hace diferentes poses. Las 2 formas de derrotarlo son: acabando matándolo, o haciendo que los índices de audiencia suban a más de 10000, lo que hará que se autodestruya por la felicidad. En la ruta genocida él se convertirá en su forma original, Mettaton NEO, un erradicador de humanos, aunque no es muy útil ya que sus defensas son muy bajas.

Es la capitana de la Guardia Real. Tiene apariencia de un pez antropomorfo. Debido a su odio por los humanos, perseguirá al protagonista sin descanso para conseguir su alma y entregársela al rey.

Es amiga cercana de Papyrus, Alphys y Asgore. Cuando se recorre la ruta genocida y es derrotada, se niega a morir y se transforma en una guerrera no muerta mucho más poderosa ya que pasa de ser Undyne a Undyne The Undying, obligando al jugador a vencerla por segunda vez. Sus ataques consisten en lanzas de energía.

Es un esqueleto perezoso y cómico, aunque nadie cree que sus bromas sean graciosas. Aparenta conocer ciertos secretos del mundo subterráneo. Se diferencia del resto de los personajes del videojuego debido a que su diálogo está escrito todo en letras minúsculas y con la fuente de caracteres Comic Sans.

Se muestra muy cercano y protector con su hermano menor Papyrus. También revela que tiene una relación amistosa con Toriel, la única que cree que sus bromas son graciosas, aunque jamás han podido hablar frente a frente. Es capaz de saber cuándo el jugador ha reseteado la partida, lo que le ha dado una personalidad derrotista por haber visto gran cantidad de realidades con malos finales.

Simultáneamente es el personaje más poderoso y el más débil de todos debido a que posee un poder de ataque que rápidamente acaba con la vida del jugador, además de una velocidad sin igual que lo convierte en el único personaje que tiene la habilidad de esquivar ataques; pero al mismo tiempo casi no posee resistencia defensiva, por lo que solo se necesita alcanzarlo con un golpe para destruirlo, aun así, es el personaje más peligroso del juego y frente al cual los jugadores obtienen el menor índice de éxito; debido a su enorme poder de ataque las batallas contra Sans implican esquivar sus variadas trampas y abrumadores disparos para intentar darle un golpe que él siempre esquivará sin dificultad, sin embargo, si el jugador resiste lo suficiente, Sans comenzará a sudar y mostrar señales de agotamiento hasta que después de una larga y cada vez más veloz pelea esté demasiado cansado para evadir un ataque sencillo que acabará con él.

Es el hermano menor de Sans, aunque parece mayor por su elevada altura. Es un esqueleto ingenuo y excéntrico, quiere capturar a un humano para conseguir ser miembro de la Guardia Real, aunque no reconoce como es un humano incluso cuando Frisk esta frente a él.

A diferencia de su hermano, su diálogo está escrito en mayúsculas y con el tipo de letra Papyrus. Es amigo cercano de Undyne, a quien admira y ve como un ejemplo a seguir. Aunque trata de ser alguien fuerte y amenazante, al final termina siendo alegre y bondadoso. Al ser un esqueleto, suele atacar usando huesos. Le encantan los puzles hasta el punto que, alguno de sus encuentros con el protagonista, en ocasiones implican la resolución de alguno.

Es un fantasma melancólico y aficionado a la música que vive en Waterfall. Tiene una granja de caracoles que administraba junto a su familia, hasta que estos desaparecieron.

Es un pequeño monstruo con la apariencia de un lagarto amarillo, carente de brazos y vestido con un jersey amarillo y marrón a rayas. Es muy inocente y enérgico, aunque también parece ser bastante torpe, pues siempre se tropieza y al no tener brazos, no puede evitar caer de cara. Además es un gran admirador de Undyne y amigo de Frisk.

Es un fantasma que habita en un maniquí cuyo sueño es llegar a ser “corpóreo”. Al conocer al humano en el vertedero de Waterfall, dice estar enfadado con él, pues su primo vivía también en un maniquí en las ruinas y el humano destruyó su hogar, o lo hizo sentir mal con sus palabras, o lo aburrió, dependiendo de las acciones del jugador. En la ruta genocida las acciones de Frisk le enfadan tanto que consigue hacerse corpóreo y "convertirse" en Glad Dummy.

Es la representante de las arañas del subsuelo. Vive en Hotland y se dedica básicamente a la venta de repostería «hecha de, por y para las arañas», con el fin de poder recaudar fondos para mover a todas las arañas atrapadas en las ruinas sin que tengan que atravesar Snowdin. Por desgracia, sus métodos de venta la llevan a ser considerada una estafadora de mucho cuidado, aunque este comportamiento no es por desear engañar, sino más bien porque su deseo de darle un mejor hogar a su especie (discriminados por el resto de razas) la ha hecho obsesiva y errática. Cuando el humano llega a su territorio lo ataca, ya que, dejándose llevar por los rumores, piensa que el humano odia a las arañas y desea lastimarlas. Aunque no es tan fuerte como los jefes finales, es el único oponente a quien Frisk no puede derrotar en las rutas normales ya que sus enfrentamientos consistirán en ganar tiempo huyendo o comprando la mercadería de Muffet hasta que ella reciba un mensaje de las arañas en las ruinas explicando que el humano nunca las ha lastimado y le deje el paso libre; sin embargo, en la ruta genocida Frisk descubre que, antes de llegar a Hotland, Sans robó su dinero y no tiene forma de entretener a Muffet, por lo que se vuelve un combate a muerte.

Es el primer humano que cayó al subsuelo, con un aspecto prácticamente idéntico al de Frisk exceptuando el color de su camiseta y los pantalones. Al caer, fue encontrado y salvado por Asriel. Desde entonces, fue acogido por la familia real, haciéndose amigo cercano de Asriel. No obstante, un día decidió comer unas flores doradas que le llevaron a la muerte. Según Asriel, cuando Chara cayó al mundo de los monstruos, no tenía buenas intenciones y odiaba a los humanos. Su plan era suicidarse, convencer a Asriel para que tomara su alma y consiguiera otras seis y así romper la barrera. En la ruta genocida se descubre que en realidad es quien ha manipulado los sucesos desde que fue adoptado por la familia real para lograr en algún momento la liberación de los monstruos y obligarlos a atacar a los humanos; en esta misma ruta se descubre que su alma se encuentra dentro de Frisk y logra el control ocasional de su cuerpo, siendo el real responsable de muchas masacres que el humano lleva a cabo. El nombre de este personaje puede variar, ya que si el jugador utiliza algún nombre que no sea el de Chara al principio del juego, varios personajes se referirán hacia Chara con el nombre que el jugador está utilizando, pero si se le pone Chara aparecerá un texto que dice: "El nombre verdadero".

Es un personaje secundario que puede realizar apariciones en el mundo de Waterfall, su aspecto es el de un pequeño animal blanco con cabellera negra y dos pares de orejas de color blanco, uno felino y el otro canino. Tiene una personalidad infantil y alegre vestido con una camiseta de colores. No solo él, sino que toda su especie se llama de la misma forma, excepto uno que se llama Bob; hay una aldea donde viven y realizan transacciones, su forma de hablar es en tercera persona normalmente con letras desordenadas pero legibles.

Es otro personaje secundario con apariencia de un perro blanco que aparece en diversas ocasiones a lo largo del juego; en la sala del artefacto legendario de Waterfall, la puerta misteriosa en Snowdin, el programa de noticias de Mettaton, al final de la ruta pacifista, en un puzle de Papyrus mordiendo el hueso de un ataque. También aparece en las ruinas en el modo difícil después de la batalla contra Toriel ya sea Genocida o Pacifista.